Что такое ОТ-ПЦР в реальном времени?

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). При том, что сейчас ОТ-ПЦР в реальном времени является наиболее широко используемым методом для выявления коронавирусов, многие страны все еще нуждаются в поддержке при внедрении и использовании этого метода.

Что такое вирус? Что такое генетический материал?

Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо ДНК, либо РНК. 

ДНК — это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.

РНК обычно представляет собой состоящую из одной цепи молекулу, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы они могли синтезировать и выполнять функции, которые поддерживают жизнь и развитие организмов. Существуют различные типы РНК, которые выполняют копирование, транскрибирование и передачу.

Некоторые вирусы, такие как коронавирус (SARS-CoV-2), содержат только РНК, что означает, что они полагаются на проникновение в здоровые клетки для размножения и выживания. Оказавшись внутри клетки, вирус использует свой собственный генетический код (РНК в случае коронавируса) чтобы взять под контроль и «перепрограммировать» клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов.  

Для того чтобы при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени выявить на раннем этапе присутствие в организме вируса, такого как коронавирус, ученым необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией». Это делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью процесса ОТ-ПЦР в реальном времени, применяемого для выявления вирусов.

Ученые амплифицируют определенную часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз. Амплификация важна, поскольку вместо того, чтобы пытаться найти ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации, ученые имеют достаточно большое количество заданных участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить, что вирус присутствует.

Как работает ОТ-ПЦР в реальном времени применительно к коронавирусу?

Из тех частей тела, где скапливается коронавирус, например из носа или горла человека, берется образец для проведения исследования. Образец обрабатывают несколькими химическими растворами, которые удаляют вещества, такие как белки и жиры, и извлекают только присутствующую в нем РНК. Эта извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК коронавируса, если она присутствует в образце.

C помощью определенного фермента в реакции обратной транскрипции РНК превращают в ДНК. Затем ученые добавляют дополнительные короткие фрагменты ДНК, которые комплементарны определенным частям транскрибированной вирусной ДНК. Эти фрагменты прикрепляются к заданным участкам вирусной ДНК, если вирус присутствует в образце. Некоторые из добавленных генетических фрагментов предназначены для построения цепей ДНК во время амплификации, в то время как другие предназначены для построения ДНК и добавления к цепям маркерных меток, которые затем используются для выявления вируса.

После этого смесь помещается в прибор для проведения ОТ-ПЦР. Прибор выполняет циклы изменения температуры, во время которых смесь нагревается и охлаждается для того, чтобы запустить определенные химические реакции, которые создают новые точные копии заданных участков вирусной ДНК. Цикл многократно повторяется, чтобы продолжить копирование заданных участков вирусной ДНК. После каждого цикла происходит удвоение количества по сравнению с предыдущим: две копии превращаются в четыре, четыре — в восемь и так далее. Обычно при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени выполняется 35 циклов; это означает, что к концу процесса из каждой цепи вируса, присутствующей в образце, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.

По мере того как создаются новые копии вирусных участков ДНК, маркерные метки прикрепляются к цепям ДНК, а затем высвобождают флуоресцентный краситель, уровень которого измеряется вычислительным устройством прибора с выводом показателя в режиме реального времени на экран. Вычислительное устройство отслеживает уровень флуоресцентного сигнала в образце после каждого цикла. Превышение этим показателем определенного уровня флуоресценции является подтверждением присутствия вируса. Ученые также смотрят, сколько циклов требуется для достижения этого уровня для того, чтобы оценить тяжесть инфекции: чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.

Зачем использовать ОТ-ПЦР?

Метод ОТ-ПЦР в реальном времени имеет высокую чувствительность и точность, с его помощью можно поставить надежный диагноз всего за три часа, при том, что лабораториям для этого обычно требуется в среднем от 6 до 8 часов. По сравнению с другими имеющимися методами изоляции вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку весь процесс может быть выполнен в одной закрытой пробирке. Это по-прежнему самый точный имеющийся метод для выявления коронавируса.

Поскольку вирусы присутствуют в теле только в течение определенного временного отрезка, ОТ-ПЦР в реальном времени нельзя использовать для выявления инфекций, появлявшихся в прошлом, что важно для понимания развития и распространения вирусов. Для выявления, отслеживания и изучения инфекций, появлявшихся в прошлом, особенно тех, которые могли развиваться и распространяться без симптомов, необходимо использовать другие методы.